3 phương pháp enzym dùng để xét nghiệm đường máu, KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM, tuyenlab.com, xét nghiệm y học, Phương pháp glucose oxydase, Phương pháp hexokinase:, Phương pháp Glucose dehydrogenase
Đường máu hay glucose máu là một xét nghiệm cơ bản dùng để đánh giá tình trạng rối loạn chuyển hóa glucid như bệnh lý đái tháo đường hay hạ đường huyết. Xét nghiệm được thực hiện bằng 2 phương pháp như hóa học và enzym. Tuy nhiên hiện nay phương pháp hóa học gần như không nơi nào dùng do không đặc hiệu và mất nhiều thời gian. Phương pháp phổ biến hiện nay là dùng enzym. Phương pháp enzym có độ đặc hiệu cao và thời gian nhanh nên rất hiệu quả. 3 loại emzym phổ biến hiện nay thường dùng để định lượng glucose máu là hexokinase, glucose oxydase và glucose dehydrogenase. Trong đó phương pháp hexokinase được coi là đặc hiệu và chính xác nhất. Trong khuôn khổ bài viết này mình sẽ chia sẻ với các bạn nội dung của 3 phương pháp enzym dùng để định lượng glucose này.
1. Phương pháp glucose oxydase:
Đây là phương pháp phổ biến với các hóa chất cho máy hóa sinh bán tự động và một số máy hóa sinh tự động. Phương pháp này kết hợp sử dụng emzym glucose oxydase và Peroxydase. Nguyên lý của phương pháp như sau:
GOD (glucose oxydase)
Glucose + H2O ------------------------------------> Acid gluconic + H2O2
POD (Peroxydase)
2H2O2+ Phenol + 4 amino-Antipyrin -----------------------------> Quinonemin + 4H2O
Phương pháp trải qua 2 bước. Đầu tiên glucose trong mẫu được oxy hóa bởi enzym glucose oxydase để tạo H2O2. Tuy nhiên glucose oxydase có đặc hiệu cao với β-glucose trong khi trong huyết thanh còn có cả α-glucose với tỉ lệ 2/3 β-glucose, 1/3 α-glucose, do vậy một số hóa chất còn có thêm cả mutarotase để chuyển α-glucose thành β-glucose. H2O2 được tạo ra tỉ lệ thuận với nồng độ glucose. Sau đó H2O2 tiếp tục tham gia phản ứng với Phenol và 4 amino-Antipyrin để tạo ra Quinonemin. Quinonemin có màu hồng cánh sen, đậm độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ Glucose. Quinonemin được đo ở bước sóng 540nm. Một số phương pháp có thể đo ngay lượng H2O2 được tạo ra mà không cần qua giai đoạn thứ 2 như máy đo đường huyết cầm tay hay máy khí máu.
Tại sao ở đây lại sử dụng Phenol và 4 amino-Antipyrin? Mục đích của phản ứng để chuyển:
Chất màu dạng khử + H2O2 ------------> Chất màu dạng Oxy hóa + H2O
Tuy nhiên trong huyết thanh có nhiều chất khử khác như acid uric, vitamin C, bilirubin... sẽ ức chế phản ứng này do cạnh tranh với chất màu trong phản ứng (ví dụ phenol) làm kết quả thấp giả tạo. Do vậy người ta đã cho thêm 4 amino-Antipyrin để loại bỏ nhiễu bởi acid uric, creatinin hoặc hemoglobin....
Ngoài ra cũng cần lưu ý nếu phản ứng bị nhiễm catalase do catalase phân hủy H2O2 .
Ưu điểm của phương pháp này là thời gian nhanh và giá thành thấp.
Nhược điểm là còn nhiều yếu tố ảnh hưởng tác động đến phản ứng và thường làm giảm nồng độ glucose so với thực tế.
2. Phương pháp hexokinase:
Đây là phương pháp phổ biến hiện nay trên các hệ thống máy tự động. Phương pháp này là chính xác nhất hiện nay. Bằng việc sử dụng men Hexokinase nên rất đặc hiệu với glucose mà không bị nhiễu bởi các carbonhydrat khác. Phương pháp trải qua 2 gian đoạn theo sơ đồ sau:
Hexokinase
Glucose + ATP -------------------------------------------> Glucose-6-Phosphat + ADP
G6PD
Glucose-6-Phosphat + NADP+ --------------------> 6-Phosphogluconat + NADPH + H+
Giai đoạn 1: Hexokinase sẽ xúc tác phản ứng phosphoryl hóa glucose tạo Glucose-6-Phosphat.
Giai đoạn 2: G6PD sẽ xúc tác phản ứng oxy hóa Glucose-6-Phosphat để tạo NADPH. Mật độ quang của NADPH tăng lên tỉ lệ thuận với nồng độ Glucose và được đo ở bước sóng 340 nm.
Cần lưu ý ở đây là Hexokinase xúc tác phản ứng phosphoryl cả fructose và mannose, tuy nhiên nồng độ các loại đường này trong máu là quá nhỏ và không đủ để gây nhiễu cho phản ứng.
Một lưu ý nữa là huyết thanh (huyết tương) vỡ hồng cầu có thể ảnh hưởng đến phương pháp này do trong hồng cầu có G6PD và 6-phosphogluconat dehydrogenase mà cả 2 enzym này cũng sử dụng NADP+ làm cơ chất. Do vậy ngày nay để giảm sự ảnh hưởng này người ta sử dụng G6PD của vi khuẩn (thay vì của nấm) vì G6PD của vi khuẩn sẽ sử dụng NAD+ thay thế NADP+
Đồng thời thay vì đo sự thay đổi mật độ quang của NADPH, hiện nay một số hóa chất sử dụng thêm một chất chỉ thị như phenazin methosulphat (PMS) hoặc Idonitrotetrazolium (INT) để tham gia phản ứng với NADPH tạo sản phẩm màu đo được ở bước sóng 520nm.
Ưu điểm của phương pháp này là có độ đặc hiệu cao. Kết quả ít bị ảnh hưởng bởi các yếu tố khác. Nhưng nhược điểm là giá thành hóa chất còn cao.
3. Phương pháp Glucose dehydrogenase (GDH).
Đây là phương pháp được sử dụng nhiều trên các máy đo đường huyết cá nhân. Phương pháp chỉ xảy ra qua 1 phản ứng:
GDH
β-D-Glucose + NAD+ ------------------------------->. D-Glucono-∆-lacton + NADH + H+
NADH tạo ra được đo ở bước sóng 340 nm dưới dạng động học hoặc điểm cuối. Ngoài ra người ta còn cho thêm mutarotase để chuyển các α-Glucose sang β-Glucose giúp kết quả được chính xác hơn.
Tuy nhiên men GDH lại cũng phản ứng với các đường khác như maltose, galactose hay xylose. Vì vậy nếu vì một lý do nào đó bệnh nhân có sử dụng các đường này trong điều trị sẽ làm kết quả tăng giả tạo. Để tránh sai số này ngày nay người ta sử dụng loại GDH được phân lập từ chủng vi khuẩn Bacillus cereus rất đặc hiệu với glucose nên sẽ cho kết quả chính xác hơn và tương đương với phương pháp Hexokinase.
Trên đây mình đã trình bày 3 phương pháp enzym dùng để định lượng đường (glucose) trong máu. Hy vọng qua bài viết các bạn sẽ hiểu được sâu hơn thêm về nguyên lý cũng như các ảnh hưởng của các phương pháp định lượng glucose. Bài viết có thể còn nhiều thiếu sót mong bạn đọc góp ý thêm. Mọi đóng góp vui lòng phản hồi tại đây. Đề nghị ghi rõ nguồn tuyenlab.com khi đăng tải lại nội dung bài viết này.
COMMENTS